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眼の試験

Preclinical ocular studies

  • 加齢黄斑変性症モデル

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    • レーザー誘発CNVモデル
    • 動物種:マウス、ラット
    • Wet Type(滲出型)の加齢黄斑変性症の動物モデルであるレーザー誘発脈絡膜血管新生モデルを用いて、薬効を評価しております。
      Wet Typeでは、脈絡膜に発生した未熟な新生血管からの出血等により、網膜剥離等の網膜障害が生じ、視覚障害を引き起こします。

      試験プロトコール概要 マウス、ラットの眼球の網膜下にレーザーを一眼あたり複数箇所照射し、レーザー誘発脈絡膜血管新生モデルを作製する。また、被験物質を各種投与経路(硝子体内投与、経口投与、腹腔内投与、静脈内投与等)にて投与する。
      レーザー照射一定期間経過後、尾静脈よりFITC-dextranを投与し、直後に眼球を摘出、固定を行う。網膜層を剥離し脈絡膜フラットマウントを作製し、共焦点レーザー顕微鏡にてFITC蛍光を指標にCNV面積を算出する。

      加齢黄斑変性症-image01

      グリーンレーザ光凝固装置(GYC-500、株式会社ニデック)

      加齢黄斑変性症-image02

      マウス・ラット用眼底観察装置(MicronⅣ、フェニックスリサーチ社)

      加齢黄斑変性症-image03 拡大-image

      マウスを用いたCNVモデル:左D-PBS、右アフリベルセプトを硝子体内投与ししたCNV面積

    • 光障害モデル試験
    • 動物種:マウス、ラット
    • Dry Typeの加齢黄斑変性症の動物モデルである光障害モデルを用い、光干渉断層計(Optical Coherence Tomography: OCT)を用い撮影した網膜断層画像より算出した網膜視細胞層の層厚、及び測定した網膜電図(Electroretinography: ERG)a波、b波の振幅値、ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色網膜断層標本より算出した網膜視細胞層の層厚等の複数指標から、被験物質の薬効を評価しております。

      試験プロトコール概要 一定期間の暗順応処理後に光照射装置を用い、網膜を障害した光障害モデル動物を作製する。また、被験物質を各種投与経路(硝子体内投与、経口投与、腹腔内投与、静脈内投与等)にて投与する。OCT網膜断層画像の撮影及びERG測定を経時的に実施する。
      モデル作製一定期間経過後、眼球を摘出、固定を行う。固定眼球はパラフィン包埋後、視神経乳頭を含む水平面で薄切した切片を作製しHE染色を行う。

      加齢黄斑変性症-image04 拡大-image

      網膜電位図測定((有)メイヨー)/光干渉断層計(OCT ㈱ニデック)

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  • 縁内障モデル

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    • 緑内障は、網膜の神経節細胞が変性脱落することにより視野欠損・失明をきたす疾患で、現状では眼圧降下が有効な治療とされおりますが、十分に眼圧を下げてもなお、進行する例が少なくありません。弊社では以下の各種動物モデルを用い、神経保護作用を評価致します。
    • 水圧負荷虚血再灌流モデル
    • 動物種:ラット
    • 緑内障の動物モデルである水圧負荷虚血再灌流モデルを用い、ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色網膜断層標本より算出した内網状層等の網膜各層の層厚及び網膜神経節細胞数などの指標から被験物質の薬効を評価しております。

      試験プロトコール概要 全身麻酔を施したラット右眼に輸液セットに装着した注射針を刺入し、前眼房内に生理食塩液を注入し眼圧をかけ、ラット水圧負荷虚血再灌流モデルを作製する。
      また、被験物質等を各種投与経路(硝子体内投与、経口投与、腹腔内投与、静脈内投与等)で投与する。 モデル作製一定期間経過後、眼球を摘出、固定を行う。固定眼球はパラフィン包埋後、視神経乳頭を含む水平面で薄切した切片を作製しHE染色を行い、層厚で評価する。

      縁内障-image01 拡大-image

      図:水圧負荷処理により内網状層厚/網膜厚の比率が約55%に低下し(Group 1 vs 2)、陽性対照物質 MK-801の硝子体内投与により保護された(Group 2 vs 4)。

      縁内障-image02 拡大-image

      図:神経節細胞層内のヘマトキシリン・エオジン染色陽性細胞数の変化

    • NMDA投与モデル
    • 動物種:マウス、ラット
    • 緑内障の動物モデルであるNMDA(N-メチル-D-アスパラギン酸)投与モデルを用い、ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色網膜断層標本より算出した内網状層等の網膜各層の層厚及び網膜神経節細胞数などの指標から被験物質の薬効を評価しております。

      試験プロトコール概要 硝子体内にNMDAを投与することによりモデルを作製する。また、被験物質等を各種投与経路(硝子体内投与、経口投与等)で投与する。
      各OCT網膜断層画像の撮影及びERG、STR(暗所閾値電位)測定を経時的に実施する。モデル作製一定期間経過後、眼球を摘出、固定を行う。
      固定眼球はパラフィン包埋後、視神経乳頭を含む水平面で薄切した切片を作製する。HE染色、TUNEL染色等の各種染色を行い、網膜神経節細胞数、網膜層厚、TUNEL陽性細胞数等の評価を行う。

      縁内障-image03 拡大-image

      図:NMDA硝子体内投与により暗順応b波振幅が低下し(Group 1 vs 2)、
      陽性対照物質 MK-801の硝子体内投与によりb波振幅の低下が緩和された(Group 2 vs 3)。

    • 緑内障性視神経症
    • 視神経挫滅モデル
    • 動物種:ラット
    • 視神経挫滅モデルを用い、陽性STR波(pSTR)の振幅値などの指標から被験物質の薬効を評価しております。

      試験プロトコール概要 視神経を専用クリップで挫滅することにより、網膜神経節細胞を障害し緑内障モデルを作製する。
      挫滅後に網膜電位を測定し、陽性STR波(pSTR)の振幅値を指標とした網膜神経節細胞の機能的評価や網膜のHE染色による形態的評価を行う。また、視神経挫滅部位を染色し神経再生評価も実施可能である。

      図:偽手術眼の左眼に比較し、挫滅処置を行った右眼のpSTRの振幅が大幅に低下しています。

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  • ドライアイ(非臨床モデル)

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    • 強制開瞼モデル
    • 動物種:ウサギ
    • ドライアイ動物モデルであるウサギ強制開瞼モデルを用い、角膜に滴下したメチレンブルーの吸光度を指標とし、被験物質の薬効を評価しております。

      試験プロトコール概要 乾燥条件下で全身麻酔を施したウサギに被験物質を点眼し、直後に開瞼器を一定期間装着し強制開瞼モデルを作製する。開瞼終了後眼球を摘出し、角膜にメチレンブルーを滴下し角膜を採取する。角膜を抽出液に浸漬し浸透を行うことにより、抽出されたメチレンブルーの吸光度を測定する。

    • 涙液量測定シルマー試験紙法
    • 動物種:ウサギ、マウス、ラット
    • 試験プロトコール概要 涙腺より涙液分泌を抑制することにより角膜混濁(ドライアイ)が起こることは良く知られている。
      各動物の涙液分泌能を評価するため、市販のシルマー試験紙を各動物に適切な幅に切断し、被験物質投与後の涙液分泌量を一定時間ごとに測定する。

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  • 糖尿病性網膜症

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    • 糖尿病性網膜症モデル
    • 動物種:ラット
    • 現在、ラット糖尿病性網膜症モデル試験の立ち上げを行っております。

      試験プロトコール概要ラットにストレプトゾトシン(STZ)を腹腔内投与しラット糖尿病性網膜症モデルを作製する。また、被験物質を各種投与経路(硝子体内投与、経口投与、腹腔内投与、静脈内投与等)にて投与する。ERGを経時的に測定し、a波、b波の振幅値、HE染色網膜断層標本より算出する。また、摘出した眼球より作製したHE染色標本より網膜神経節細胞数などの指標から被験物質の薬効を評価する。

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  • 各種測定方法

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    • VEP(視覚誘発電位)測定
    • 動物種:ラット
    • 視覚誘発電位(Visual evoked potentials, VEP)とは、視覚への刺激による大脳の視覚野に生じる電位です。
      ラットVEP(視覚誘発電位)測定用モデルを用い、被験物質が視機能に及ぼす薬効を評価しております。

      試験プロトコール概要 ラット頭蓋部より視覚野領域に電極を埋め込みVEPが測定できるモデルを作製する。
      短波長、長波長等、種々の波長の光で刺激しVEPを測定する。
      測定により得られたVEP陽性波ピーク(P波)及び陰性波ピーク(N波)を計測し、P波とN波の振幅値の差分値を算出し、視覚野の反応を数値化し、視覚の回復程度を評価する。

      図:長波長で光強度の条件にてVEP測定を実施した結果、両眼いずれもVEP波形のP波、N波が確認された。

    • 多局所網膜電図(mfERG)測定
    • 使用動物:ラット
    • 人工多能性幹細胞等を網膜下投与で投与し、37区画に分割した網膜の各区画の網膜電図を取得し、各区画の波形の振幅値からグループ波形図を作製し、局所の波形変化を評価する。

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  • その他モデル動物・評価、遺伝子改変動物

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    • NMU(N-Methyl-N-nitroso Urea)投与モデル
    • 動物種:ウサギ・ラット・マウス
    • 視細胞層の保護効果を視細胞層厚、OCT、ERG等で評価する。

      その他、各種病態モデル動物及び遺伝子改変動物を用いた試験が可能です。
      以下の各試験にも豊富な実績を有しております。
      ・各種トランスジェニック、ノックアウト動物(視機能関連遺伝子ノックアウトマウス、変異ロドプシントランスジェニックウサギ等)
      ・各種自然発症疾患モデル動物(網膜色素変性症モデルRCSラット等)
      ・遺伝子導入用ウイルスベクターを用いた網膜への遺伝子導入動物作成
      上記以外にもP1A、P2A対応の施設を保有しておりますので、多種多様な遺伝子改変動物及び遺伝子導入ベクターの投与試験が実施可能です。お気軽にご相談下さい。

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